Антарктические биотопы, Exophiala nigra, продуценты меланина. Скрининг

Впервые «черные дрожжи» Nadsoniella nigra были обнаружены академиком Б.Л. Исаченко 100 лет назад в воде Арктики на глубине 5–10 м [4, 5]. впоследствии дрожжи Nadsoniella nigra var. hesuelica изолированы из Антарктики (из образца примитивной почвы, взятой с ост- рова хесуэлл) [8] и использованы для получения меланина [6]. Цель нашей работы – скрининг дрожжей-продуцентов меланина в наземных биотопах островов Аргентинского архипелага, а также западного побережья Антарктического полуострова. Такая постановка задачи обусловлена тем, что меланин успешно используется в медицине и фармакологии [2, 7], т.к. участвует в репарации ДНК, является модулятором таких важных систем клеточного метаболизма как фото- и радиопротекция, нейтрализует продукты перекисного окисления липидов и участвует в нейромедиаторных процессах при многочисленных патологических нарушениях функциональных структур нейронов. 

В результате был разработан Институтом физиологии им. П. Богача киевского Национального университета им. Тараса Шевченко при поддержке Украинского антарктического центра, Анкарцин Амрита.

Продукт прошел медико-биологические и клинические испытания, разрешен к применению Министерством здравоохранения Украины. Является нетоксичным, безвредным (согласно ГОСТ 12.1.007-76).
Украинскими ученными была проведена научная работа с которой мы и хотим вас познакомить.

В настоящее время считается, что меланин перспективен для применения в медицине и фармакологии. В связи с тем, что ранее в полярных регионах были обнаружены чёрные дрожжи, нами проведен скрининг дрожжей-продуцентов меланина в антарктических биотопах. Тёмнопигментированные микроорганизмы выявлены в 30 % образцов наземных биотопов на западном побережье Антарктического полуострова, на островах Аргентинского архипелага (Galindez, Skua, Corner, Barchans, Irizar, Uruguay, Cruls, Three little pig, King-Georg), а также на близлежащих к ним островах Petermann, Jalour, Berthelot; Darboux и Lippmann. В антарктических лишайниках частота встречаемости тёмнопигментированных микроорганизмов, их общее количество, а также биоразнообразие значительно выше, чем в других антарктических биотопах. Угольно-чёрные дрожжи обнаружены на накипных и кустистых лишайниках на вертикальных скалах, реже встречаются в почве, их количество составляло 1×102 – 6×103 КОЕ/г образца. Из двух антарктических штаммов дрожжей, предварительно отнесенных к виду Exophiala nigra, выделены угольно-чёрные пигменты. По комплексу специфических химических тестов эти пигменты идентичны меланину, что подтверждается также характером УФ-спектров (в области 220– 230 нм) и спектров поглощения в видимой области (400–800 нм). Выход меланина у штамма 36 составлял более 10 % от количества биомассы. В целом, в наземных антарктических биотопах выявлены дрожжи, интенсивно синтезирующие меланин.
Впервые «черные дрожжи» Nadsoniella nigra были обнаружены академиком Б.Л. Исаченко 100 лет назад в воде Арктики на глубине 5–10 м [4, 5]. впоследствии дрожжи Nadsoniella nigra var. hesuelica изолированы из Антарктики (из образца примитивной почвы, взятой с ост- рова хесуэлл) [8] и использованы для получения меланина [6]. Цель нашей работы – скрининг дрожжей-продуцентов меланина в наземных биотопах островов Аргентинского архипелага, а также западного побережья Антарктического полуострова. Такая постановка задачи обусловлена тем, что меланин успешно используется в медицине и фармакологии [2, 7], т.к. участвует в репарации ДНК, является модулятором таких важных систем клеточного метаболизма как фото- и радиопротекция, нейтрализует продукты перекисного окисления липидов и участвует в нейромедиаторных процессах при многочисленных патологических нарушениях функциональных структур нейронов.
Материалы и методы. Выделение антарктических микроорганизмов и изучение их свойств. Образцы для микробиологических исследований отбирали стандартными методами в наземных биотопах (наскальные биоплёнки, почва, лишайники и мхи) островов Аргентинс- кого архипелага, а также западного побережья Антарктического полуострова. Микроорганиз- мы выделяли из нативных (хранение при температуре +5 oС, 10 сут.) и замороженных (хра- нение при -20 oС, 30 сут.) образцов. Количество микроорганизмов в исследуемых образцах определяли путём посева последовательных десятикратных разведений образцов (0,1 мл) на сусло-агар (СА). Чистые культуры изолировали общепринятыми методами и культивировали на СА (15–20 oС, 5–15 сут.).
Морфологию клеток (форма клеток, размеры, почкование, наличие внутриклеточных включений) изучали с помощью фазо-контрастной микроскопии живых клеток, образование спор и капсул определяли общепринятыми методами. Морфолого-культуральные свойства Штамм 36 по основным диагностическим свойствам подобен штамму УКМ Y-2299, ко- торый был изолирован из образца накипных лишайников на вертикальных скалах острова Галиндез (Антарктика) и депонирован в УКМ как Exophiala nigra (Issatsch.) Haase et de Hoog 1999.
в целом, так называемые «черные дрожжи» (класс Euascomycetes) – это группа несовер- шенных дрожжеподобных грибов аскомицетового аффинитета, характеризующихся образо- ванием черных или бурых либо чернеющих со временем колоний за счет синтеза меланинов. К ним относятся представители родов Exophiala, Aureobasidium, Hormonema, Botryomyces, Phaeotheca, Sarcinomyces, Phialophora, Rhinocladiella, Phaeococcomyces. Образование аскос- пор у них наблюдается редко, в связи с чем их систематика строится в основном на способах образования конидий [1]. Авторы, предложившие данную трактовку, считают, что многие роды этих грибов формальны, то есть заведомо филогенетически гетерогенны и не соответс- твуют точно известным телеоморфам.
Характеристика пигмента. При культивировании в жидком солодовом сусле (рН 5.5- 6.0) штамм 36 синтезирует водонерастворимый внутриклеточный угольно-чёрный пигмент. Клетки хорошо осаждаются при центрифугировании в диапазоне 1000-5000 об/мин. в супер- натанте пигмент отсутствует. На глюкозо-картофельной жидкой среде пигментация менее вы- ражена, чем на солодовом сусле. После выращивания штамма 36 в жидком солодовом сусле (рН 5.5–6.0, 5 сут.) пигмент был экстрагирован и высушен.
Пигмент антарктического штамма 36 нерастворим в воде, однако растворяется в щёлочи. в органических растворителях (эфир, ацетон, хлороформ, бензол, н-бутанол) пигмент нерас- творим. в этаноле – нерастворим или слабо растворим. в тетрагидрофуране (растворитель так называемых меланоидинов) пигмент не растворялся. Считается, что меланины не рас- творяются в концентрированных кислотах. Действительно, меланин, синтезируемый антар- ктическим штаммом 36, не растворялся в концентрированной HCl, однако он растворялся в других концентрированных кислотах (H2SO4 и HNO3) в разбавленных кислотах меланины не растворялись.
По комплексу вышеуказанных специфических тестов экстрагированный пигмент штамма 36 идентичен меланину, синтезируемому штаммом УКМ Y-2299, а также подобен меланину та- ких микроорганизмов как Nadsoniella nigra var. hesuelica 365 [9] и Cladosporium sp. 396 [3, 11].
Чтобы определить интенсивность синтеза меланина, щелочную экстракцию пигмента из биомассы штамма 36 проводили трижды (до полного извлечения пигмента из клеток). Да- лее меланин и параллельно оставшуюся светло-серую дрожжевую биомассу высушивали до абсолютно сухой массы и взвешивали на аналитических весах. Соответствующие расчеты показали, что выход меланина составлял более 10 % от абсолютно сухой дрожжевой биомассы, что свидетельствует о высокой интенсивности синтеза меланина у штамма 36.
характер УФ-спектров различных фракций пигмента штамма 36, растворённых в NaOH (0,5 N) и аммиаке (2 %) практически не отличались. Максимальное поглощение находилось в области 220-230 нм (рис. 2). Спектр поглощения пигмента штамма 36 в видимой области (400-800 нм) имел форму практически прямой линии (без резкого снижения). Для сравне- ния были взяты несколько фракций меланина, синтезируемого Exophiala nigra УКМ Y-2299. Показано, что характер УФ-спектров и спектров поглощения в видимой области (400-800 нм) различных фракций пигмента штамма 36 и УКМ Y-2299 идентичны. Аналогичные спектры показаны ранее для меланинового пигмента Nadsoniella nigra штамм 365 [9]. На основании полученных результатов мы полагаем, что антарктический штамм 36 синтезирует меланины.

СКРИНІНГ ДРІЖДЖІВ-ПРОДУЦЕНТІВ МЕЛАНІНУ ІЗ НАЗЕМНИХ АНТАРКТИЧНИХ БІОТОПІВ
Резюме
в даний час вчені вважають, що меланін може використовуватись у медицині і фармакології. Раніше
в полярних регіонах було виявлено чорні дріжджі, тому нами проведено скрінінг дріжджів-продуцентів меланіну в антарктичних біотопах. Темнопігментовані мікроорганізми виявлено в 30 % зразків наземних біотопів на західному узбережжі Антарктичного півострова, на островах Аргентинського архіпелагу (Galindez, Skua, Corner, Barchans, Irizar, Uruguay, Cruls, Three little pig, King-Georg), а також на островах Petermann, Jalour, Berthelot; Darboux и Lippmann. в антарктичних лишайниках частота виявлення темнопігментованих мікроорганізмів, їх загальна кількість а також біорізноманіття значно вище, ніж в інших антарктичних біотопах. вугільно-чорні дріжджі знайдено на накипних й кустистих лишайниках на вертикальних скелях, інколи вони зустрічаються у ґрунтах, їх кількість складала 1×102 - 6×103 /г зразка. Із двох антарктичних штамів дріжджів, які за попередніми даними подібні Exophiala nigra, екстраговано вугільно-чорні пігменти. За комплексом специфічних хімічних тестів ці пігменти ідентичні меланіну, що підтверджено характером УФ-спектрів (в області 220–230 нм) й спектрів поглинання у видимій області (400–800 нм). вихід меланіну у штама 36 складав 10 % від кількості біомаси. Загалом, в наземних антарктичних біотопах виявлено дріжджі, які інтенсивно синтезують меланін.
*Работа выполнена при частичном финансировании за счет бюджетных средств для поддержки объекта национального достояния – «Коллекции микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины».
© А.Б. Таширев, В.А. Романовская, С.О. Шилин, Н.А. Черная, 2010
ISSN 0201-8462. Мікробіол. журн., 2010, Т. 72, No 1 3
А.Б. Таширев, В.А. Романовская, С.О. Шилин, Н.А. Черная
Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины
ул. Академика Заболотного, 154, Киев ГСП, Д03680, Украины.

Использованная литература:

1. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей. – Москва: Товарищество научных изданий КМК, 2004. – 221 с.
2. Борщевская М.И., Васильева С.М. Развитие представлений о биохимии и фармакологии меланиновых пигментов // вопросы медицинской химии. – 1999. –45, No 1. – С. 47–53.
3. Жданова Н.Н., Свищук А.А., Шмыгун М.П., Бондарь А.И. О защитном действии пигмента, выделенного из гриба Cladosporium sp. // Микробиология. – 1970. – 39, No4. – С. 603–607.
4. Исаченко Б.Л. Изследованія надъ бактеріями Севернаго Ледовитаго Океана. – Петроградъ: Типографія в.О. Киршбаума, 1914. – 297 c.
5. Исаченко Б.Л. Избранные труды. – Москва-Ленинград: Изд. Академии наук СССР, 1951. – Т. 1. – 408 c. 6. Лях С.П. Патент RU (11) 2069696 (13) C1. Продуцент противоопухолевого меланинсодержащего
препарата «Астромеланин». Опубл. 27.11.1996.
7. Лях С.П., Рубан Е.Л. Микробные меланины. – Москва: Наука, 1972. – 238 с.
8. Лях С.П., Рубан Е.Л. Антарктические «черные дрожжи» Nadsoniella nigra var. hesuelica (характеристика
и идентификация штамма 365) // Известия АН СССР. Сер. биол. – 1970. – No 4. – С. 581–592.
9. Рубан Е.Л., Лях С.П., Хрулева И.М., Титова И.А. Меланиновые пигменты Nadsoniella nigra // Известия
АН СССР. Сер. Биол. – 1969. – No 1–3. – C. 134–148.
10. Таширев А.Б., Романовская В.А., Сиома И.Б., Усенко В.П., Таширева А.А., Матвеева Н.А., Рокитко П.В.,
Копытов Ю.П., Серединин Е.С., Мизин Д.А., Подгорский В.С. Антарктические микроорганизмы, устойчивые к высоким концентрациям Hg2+, Cu2+, Cd2+ и СrО42– // Доповіді НАН України. – 2008. – No 1. – С. 169–176.
11. Шмыгун М.П., Жданова Н.М., Свищук А.А. Про належність темного пігменту Oidiodendron cerealis до меланіну // Мікробіол. журн. – 1975. – 37, No 6. – С. 700–702.
12. Bainbridge B.W, Bull A.T., Pirt S.J., Rowley B.I. Trinci A.P.J. Biochemical and structural changes in non- growing mainta

Меланин + ДОФА. Анкарцин FORTE. Раствор на нано кластерах серебра 8,25мг/мл Производитель: Amrita Анкарцин®-раствор FORTE это комплексное оздоровление организма на клеточном уровне. Биотехнологичный антиоксидант для базисной очистки организма на клеточном уровне, восстановления метаболических процессов в клетках и снижения риска их злокачественного перерождения. Анкарцин Форте содержит: растворимый...  Подробнее →

Анкарцин® Optimum, 50 мл. Раствор на серебре 1,8мг/мл Производитель: AmritaАнкарцин® в капсулах на протяжении последних 12-ти лет проявляет себя как уникальный продукт комплексного действия, аналогов которому нет, не только в Украине, но и за рубежом. Будучи разработанным нашими учеными и пройдя ряд клинически к исследований, Анкарцин в капсулах помог белее чем 50 тысячам...  Подробнее →

Анкарцин® свечи, суппозитории.10 свечей Производитель: Amrita Анкарцин®-свечи. Оздоровление организма на клеточном уровне. Для ректального и вагинального использования, эффективно дополняет существующие терапевтические схемы приема. Состав: растворимый полифенолкарбоновый комплекс (эумеланин, тирозин, ДОФА), жир растительный. Общая характеристика: «Анкарцин®-свечи»...  Подробнее →

Меланин+ ДОФА. Анкарцин Раствор.0,125 мг/мл. Антиоксидант Производитель: Amrita В производстве Анкарцин раствор была использована оригинальная технология стабилизации, полифенолкарбоновый комплекс (ПФК) , выделенный из микроорганизмаNadsoniella nigra х-1 (черные антарктические дрожжи)в результате был получен не имеющий аналогов в мире, растворимый полифенолкарбоновый комплекс (эумеланин,...  Подробнее →